近日，海南大学李海燕团队在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了”GmAKT1-mediated K⁺ absorption positively modulates soybean salt tolerance by GmCBL9-GmCIPK6 complex”的研究论文。该研究工作通过创制过表达和敲除大豆材料，鉴定到钾离子通道蛋白基因GmAKT1具有正向调控大豆耐盐性的作用。然后，对GmAKT1的上游调控网络进行解析，通过互作蛋白筛选，明确了大豆中存在GmAKT1与GmCIPK6以及GmCIPK6与GmCBL9的相互作用关系，以此构成一个“GmCBL9-GmCIPK6-GmAKT1”调控大豆耐盐性的分子模块。进一步，结合电生理体系以及多基因聚合大豆材料表型分析等，揭示GmCBL9-GmCIPK6复合体通过磷酸化并激活GmAKT1对K⁺的吸收，进而维持体内Na⁺/K⁺平衡，最终提高大豆耐盐性的分子机制。

大豆[Glycine max (L.) Merr.]是世界第一大豆科作物，也是重要的粮、油、饲兼用作物，与国民经济息息相关。然而，我国大豆单产一直增加缓慢，加之人们对优质蛋白和食用油的需求日渐增多，国内较低的大豆产量已无法满足人们需求，每年约85%大豆来源于进口，这一现状已成为我国大豆在国际竞争中“卡脖子”的关键因素。此外，大豆作为一种中度盐敏感作物，在土壤盐度电导率（ECe）超过5 ds/m的条件下，其植株的致死率和叶片坏死现象会显著加剧，进而导致大豆产量下降50%，对我国粮食安全造成极大影响（Phang et al., 2008; Zhao et al., 2020）。因此，充分利用盐碱土地，培育耐盐大豆新品种（系）已迫在眉睫。值得注意的是，盐胁迫下大量的Na⁺进入植物细胞中会抑制K⁺吸收,进而导致Na⁺/K⁺比失衡，最终造成植物细胞损伤和营养缺乏（Anschütz et al., 2014；Ismail et al., 2017；Li et al., 2023）。因此，维持细胞内钠离子/钾离子（Na⁺/K⁺）平衡是植物耐盐的关键因素之一(Yang et al., 2018)。此外，盐胁迫下一些离子通道或转运体蛋白可通过调节K⁺吸收或Na⁺外排进而维持Na⁺/K⁺平衡（Zhu et al., 2016）。然而，目前研究主要集中于Na⁺转运调控机制方面，有关盐胁迫下K⁺转运的分子机制研究仍相对有限（Wang et al., 2020; Jia et al., 2021; Chen et al., 2023）。海南大学李海燕课题组在大豆中鉴定到一个K⁺通道蛋白基因GmAKT1，且该蛋白受到上游GmCBL9-GmCIPK6复合体的调控，阐明了K⁺调控大豆耐盐性的分子机制。全文主要研究结果如下：

1. K⁺通道蛋白基因GmAKT1正向调控大豆耐盐性

研究人员首先对GmAKT1的过表达和敲除大豆进行盐胁迫处理，发现盐胁迫下过表达GmAKT1株系的Fv/Fm以及根和叶片中的干鲜重显著高于野生型，而在敲除GmAKT1株系则显著低于野生型 (图1b-f)。进一步研究表明，盐胁迫下过表达GmAKT1根和叶片中的Na⁺含量以及Na⁺/K⁺比值显著低于野生型，K⁺含量显著高于野生型，而敲除GmAKT1株系则与之相反。通过以上研究表明GmAKT1基因可通过调节K⁺吸收，进而维持Na⁺/K⁺平衡，最终增强大豆耐盐性（图 1g-k）。

图1 GmAKT1在大豆中的耐盐性鉴定

2. 蛋白激酶GmCIPK6相互作用并磷酸化修饰GmAKT1

为了进一步探究GmAKT1是否受到上游蛋白激酶GmCIPKs的调控，进而提高大豆耐盐性，研究人员首先鉴定并克隆了26个大豆GmCIPKs基因，并利用Y2H实验验证了GmAKT1与GmCIPK4、GmCIPK6、GmCIPK14和GmCIPK23具有相互作用关系（图 2a）。然后，通过BiFC和Co-IP实验证实了在植物体内GmAKT1与GmCIPK6也存在相互作用关系（图 2b-c）。在此基础上，明确了GmAKT1中的Ankyrin是与GmCIPK6相互作用的关键功能结构域（图 2d）。最后，通过Mn²⁺-phos-tag SDS PAGE以及Western blot检测，验证了GmCIPK6可以磷酸化GmAKT1及其磷酸化位点（图 2e-g）。这些研究结果证实，GmAKT1介导K⁺吸收受到GmCIPK6的磷酸化激活作用。

图2 GmCIPK6相互作用并磷酸化修饰GmAKT1的验证

3. GmCIPK6活性受到上游钙离子感受器GmCBL9的调控

为了明确GmCIPK6是否受到上游钙离子（Ca²⁺）感受器GmCBLs的调控，研究人员首先通过Y2H实验证明了GmCIPK6与大豆中的GmCBL1、GmCBL2以及GmCBL9相互作用（图 3a）。进一步通过BiFC和Co-IP实验证了在植物体内GmCIPK6与GmCBL9存在相互作用关系（图 3b-c）。值得注意的是，研究者通过亚细胞定位分析发现，GmCBL9和GmAKT1定位在细胞膜上，GmCIPK6定位在细胞核上（图 3d）。而BiFC结果显示，GmCBL9与GmCIPK6以及GmCIPK6与GmAKT1相互作用后都定位在细胞膜上（图 2b，3b），通过以上结果，研究者推断GmCBL9与GmCIPK6相互作用后，GmCBL9可能将GmCIPK6从细胞核招募至细胞膜上，进而使GmCIPK6与定位在细胞膜上的GmAKT1发生相互作用。

图3 GmCIPK6相互作用GmCBL9的鉴定

4. GmCBL9-GmCIPK6复合体通过磷酸化激活GmAKT1以提高大豆的耐盐性

为了进一步明确GmAKT1介导K⁺吸收是否受到Ca²⁺-GmCBL9-GmCIPK6复合体的调控，研究者利用全细胞膜片钳检测不同转染细胞中K⁺向细胞内整流的情况。首先，将钙离子感受器GmCBL9中与Ca²⁺结合的位点进行突变，发现转GmCBL9^E172Q、GmCIPK6和GmAKT1的HEK293T细胞中，K⁺向细胞内整流趋势显著降低（图 4d-e），表明GmAKT1介导K⁺吸收依赖于Ca²⁺信号网络的调控。进一步研究发现，与单转GmAKT1的细胞相比较，共转GmCBL9、GmCIPK6和GmAKT1细胞中K⁺向细胞内整流趋势显著增加，表明Ca²⁺-GmCBL9-GmCIPK6复合体促进GmAKT1对K⁺吸收（图4a-b）。此外，为了验证GmAKT1介导K⁺吸收是否依赖于上游GmCBL9-GmCIPK6的磷酸化调控，研究者将GmAKT1的磷酸化位点进行突变，然后对转GmCBL9、GmCIPK6和GmAKT1^S730A的细胞进行电流检测，发现GmAKT1的磷酸化位点突变后，K⁺向细胞内整流趋势显著降低（图4c）。通过以上研究结果，表明了GmAKT1介导K⁺吸收依赖于Ca²⁺-GmCBL9-GmCIPK6复合体的磷酸化修饰作用。另外，研究者以过表达/敲除GmAKT1以及野生型大豆为背景材料，利用大豆发状根体系分别过表达GmCBL9、GmCIPK6以及GmCBL9+GmCIPK6基因至上述大豆材料中，并通过分析盐胁迫下不同转基因大豆发状根的表型、Na⁺、K⁺含量以及Na⁺/K⁺比值的变化关系（图 4f-i），揭示了GmCBL9-GmCIPK6复合体通过磷酸化并激活GmAKT1对K⁺吸收，以维持体内Na⁺/K⁺平衡，最终提高大豆耐盐性。

图4 GmCBL9-GmCIPK6复合体通过调控GmAKT1提高大豆的耐盐性

这项研究证实了钾离子通道蛋白基因GmAKT1参与调控大豆耐盐性的分子机制，即盐胁迫下Ca²⁺感受器GmCBL9接收到Ca²⁺后，将蛋白激酶GmCIPK6从细胞核招募至细胞膜上，进一步GmCIPK6通过磷酸化作用激活了定位在细胞膜上的K⁺通道蛋白GmAKT1。通过GmCBL9-GmCIPK6-GmAKT1这一分子模块的调控，促进了K⁺吸收，进而维持细胞内Na⁺/K⁺平衡，最终提高大豆的耐盐性（图 5）。

图5 GmCBL9-GmCIPK6-GmAKT1调控大豆耐盐性的作用模型

海南大学南繁学院（三亚南繁研究院）博士后冯晨和Muhammad Azhar Hussain（已出站）为该论文共同第一作者，海南大学南繁学院（三亚南繁研究院）李海燕教授和周永刚副教授为论文的共同通讯作者。研究工作得到了农业部科技创新2030-农业生物育种重大项目、国家自然科学基金和中国博士后科学基金的资助。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70042.